Proč medové houby svítí ve tmě?

Byl odhalen mechanismus bioluminiscence vyšších hub, byla stanovena struktura nového unikátního luciferinu – 3-hydroxyhispidinu – a cesta jeho biosyntézy z jeho prekurzoru a byla získána data potvrzující jediný biochemický mechanismus houbové bioluminiscence zahrnující dva substráty a dva enzymy. Látky lze použít jako světelné markery v ekologii a medicíně.

1. Studium svítících vyšších hub.

Schopnost některých hub vydávat v různých fázích svého růstu světlo viditelné ve tmě je lidstvu známá již od starověku. K dnešnímu dni bylo objeveno více než 80 druhů svítících hub v různých oblastech světa – v Severní a Jižní Americe, Evropě, Asii (včetně Sibiře), Austrálii a Africe.

Při realizaci projektu jsme zjistili, že mnoho druhů „nesvítivých“ vyšších hub má slabou záři – chemiluminiscenci. Analýza těchto dat a dat známých z literatury nám umožnila navrhnout, že chemiluminiscence hub se stala metabolickým základem, ze kterého během evoluce vznikla viditelná bioluminiscence hub.

Hlavními objekty výzkumu během projektu bylo mycelium tří druhů svítících vyšších hub (obr. 1): Neonothopanus nambi (IBSO 2307) – izolován v tropických pralesích jižního Vietnamu vietnamským výzkumníkem Dao Thi Vanem; Armillaria borealis — Marxm. & Korhonen (IBSO 2310) – zvýrazněno N.V. Pashenova (IL SB RAS) v okolí Krasnojarsku (Rusko); Panellus stipticus (IBSO 2301) – zvýrazněno G.A. Vydryakova na předměstí Ottawy (Kanada).

Rýže. 1. Vzhled (vlevo) a záře (vpravo) kolonií mycelia tří druhů vyšších hub, když jsou kultivovány v umělých podmínkách.

Během projektu byly objeveny další dvě svítící houby. Během vědecké cesty A.P. Bublina, K.V. Purtov a A.E. Búrové objevili svítící houbu, která roste na pařezech kokosových palem na ostrově Borneo (Malajsie). S.E. Medveděva objevil v okolí Krasnojarska svítící houbu patřící do rodu armillaria (medové houby). Identifikace druhů detekovaných hub se provádí společně s BIN RAS (St. Petersburg, Rusko).

2. Byly vytvořeny podmínky pro hluboké pěstování svítících vyšších hub

Vývoj podmínek pro kultivaci světlých hub v laboratorních podmínkách za účelem získání biomasy mycelia se stabilní září otevírá možnosti pro provádění široké škály studií: morfologické vlastnosti světélkujících hub; organizace luminiscenčních systémů a mechanismů záře hub; možnosti využití houbové záře pro analytické účely.

Kultivace mycelia se provádí dlouhodobě (8 – 10 dní).
Při odběru vzorků mycelia pro pokusy dochází k poškození houby.
V reakci na poškození je ve vzorcích mycelia umístěných v kyvetě luminometru pozorována pomalá kinetika vzestupu luminiscence na maximum (od 40 minut do 5 hodin), po níž následuje pomalá (několik hodin) kinetika poklesu signálu k stacionární úroveň.

Získejte mycelium ve formě jednotlivých kulovitých globulí již po 3 dnech kultivace.
Globule lze snadno přenést z jednoho kapalného média do druhého a umístit do měřicí cely luminometru. V tomto případě je houba vystavena minimálnímu mechanickému namáhání a poškození.
Globule zavedené do měřicí cely dávají stejný typ luminiscenčního signálu (obr. 2). Zaznamenané signály se liší pouze počáteční úrovní luminiscence, která závisí na velikosti globule, a mají rychlou (3 – 5 min) kinetiku rozpadu dosahující stacionární úrovně.

Rýže. 2. Nahoře: vzhled a záře podhoubí získané při pěstování na pevném médiu (1) a při použití metody kultivace ponořené pod vodu (2). Dole: globule mycelia v měřicí cele (vlevo), luminiscenční signály z jednotlivých globulí (vpravo).

3. Byla navržena hypotéza o mechanismu luminiscence vyšších hub

Co se týče mechanismů luminiscence vyšších hub, existují dva alternativní názory: 1) bioluminiscence je spojena s fungováním klasického enzym-substrátového systému luciferáza – luciferin, podobného tomu, který existuje u bakterií a zvířat; 2) záře je spojena s chemiluminiscenční reakcí bez účasti specializovaného enzymu.

Náš výzkum charakteristik houbové luminiscence Neonothopanus nambi umožnil identifikovat dva faktory, které stimulují jeho bioluminiscenci – peroxid vodíku a nízkomolekulární složku nacházející se v extraktech z mycelia. Předpokládá se, že detekovaná součást (pojmenovaný nambin), je emitorem (emitorem) doutnavé reakce. Současné přidání nambinu a N₂О₂ způsobuje silnou záři myceliových globulí, která může trvat několik hodin. S opakovaným přidáváním H₂О₂, mycelium opět reaguje jasnou září. Analogie se známou chemiluminiscenční reakcí luminol – H₂О₂ nám umožnilo formulovat hypotézu o možném mechanismu luminiscence houby (obr. 3). Na základě mechanismu mohou roli katalyzátoru pro luminiscenci hub hrát ionty přechodných kovů, enzymy s oxidázovou funkcí (například peroxidázy) nebo ergosterol (provitamin D₂). V budoucnu se plánuje izolovat nambin v jeho čisté formě a studovat jeho strukturu a vlastnosti.

Výsledky studií naznačují, že radiační systém N. Nambi se nachází na buněčné stěně houby nebo v jejích strukturálních prvcích, protože při jakékoli metodě ničení mycelia zcela ztrácí svou schopnost zářit. Bylo navrženo schéma pro aktivaci houbové záře (obr. 3).

Rýže. 3. Nahoře: Hypotetický mechanismus pro houbovou záři N. Nambi (analogicky s chemiluminiscenční reakcí luminol – H₂О₂). Dole: Navrhovaný vzor aktivace houbové záře.

Faktory stimulující luminiscenci hub jsou procesy doprovázené tvorbou reaktivních forem kyslíku (ROS). Jejich tvorbu lze aktivovat: a) účinky na buněčnou stěnu houby (mechanické, fyzikální, chemické); b) metabolické změny v houbě vedoucí k narušení enzymových systémů, zejména ligninolytického komplexu, systému cytochromu P-450 a dýchacího řetězce.

Publikováno v.
1. Gitelzon I.I., Bondar V.S., Medveděva S.E., Rodicheva E.K., Vydryakova G.A. Chemiluminiscenční záře pletiv plodnic vyšších hub // DAN, 2012, v. 443, č. 5, s. 624-627.
2. Bondar VS, Shimomura O., Gitelson JI Luminiscence vyšších hub (recenze) // Journal of Siberian Federal University. Biology., 2012, Vol.5, No.4, pp.331-351.
3. Buzyr A.P., Burov A.E., Medvedeva S.E. Extracelulární bioluminiscence metabolitů mycelia světélkující houby Panellus stipticus (IBSO-2301) během růstu na agarovém médiu // DAN, 2013, v. 448, č. 4, s. 487-489.
4. Bondar V.S., Rodicheva E.K., Medvedeva S.E., Tyulkova N.A., Tyaglik A.B., Shpak B.A., Gitelzon I.I. K mechanismu luminiscence houby Neonothopanus nambi // DAN, 2013, v. 449, č. 2-223.
5. Puzyr AP, Burov AE, Bondar VS Zdroj emise světla ve světelném myceliu houby Panellus stipticus // Journal of Research in Biology, 2013, Vol.3, No.3, pp.900-905.
6. D.T. Van, Manukovsky N.S., Gitelzon I.I. Chemiluminiscence pěstovaných hub Vietnamu // DAN, 2013, v. 448, č. 3, s. 349–350.